Microbiologia para Todos

A biotecnologia se baseia no uso de micro-organismos, células ou componentes celulares para fazer pesquisas ou um produto, como: Alimentos, vacinas, antibióticos e vitaminas.

Um exemplo são micro-organismos e plantas que estão sendo usados como fábricas para produzir substâncias químicas que os organismos não produzem naturalmente.

Tudo isso é feito por meio da inserção de genes em células, chamado de DNA recombinante.

Tecnologia do DNA recombinante

Um gene de um animal pode ser inserido no DNA de uma bactéria. Deste modo, podemos fazer o receptor expressar o gene, que pode codificar um produto comercialmente útil. Por exemplo:

• Bactérias com genes insulina são usadas para produzir o hormônio
• Leveduras portadores de um gene que codifica parte do capsídeo viral do vírus da hepatite B pode ser usado para confecção de vacinas, para que não tenha que ser feita com o micro-organismo completo
• Criar cópias de uma mesma molécula de DNA, para o uso em experimentos e análises

Visão geral da tecnologia do DNA recombinante

O procedimento se baseia em 4 passos:

Primeiramente, o gene de interesse é inserido no DNA de um vetor in vitro. O DNA deve ser auto replicativo como um plasmídeo ou um genoma viral.

Depois o vetor recombinante de DNA é introduzido em uma célula onde ele pode multiplicar-se.

A célula que contém o vetor é multiplicada em cultura para formar um clone de muitas células geneticamente idênticas. Assim, o clone de células possui diversas cópias do gene de interesse.

A etapa final irá depender do objetivo da clonagem. A partir do clone de células, o pesquisador pode isolar grandes quantidades do gene de interesse e utilizá-lo para diversos propósitos.

Essa tecnologia foi usada para a produção de hormônios do crescimento humano(hGH), já que algumas pessoas não produzem em quantidades adequadas e apresentam deficiência no crescimento. Antigamente, para se adquirir o hormônio, extraia-se diretamente das glândulas pituitárias humanas, o que levava a vários riscos. Atualmente, o hGH é geneticamente produzido por vetores E. Coli, o que é muito mais barato, rápido e seguro.

Selecionar o DNA desejado

Para separar uma parte específica do DNA, os engenheiros genéticos utilizam de enzimas de restrição. Elas são uma classe de enzimas que clivam(digerem) o DNA e estão presentes em diversas bactérias.

Essas enzimas já haviam sido observadas a muito tempo por pesquisadores. Eles observaram que quando bacteriófagos tentavam infectar bactérias que não eram suas hospedeiras naturais eles tinham o seu DNA destruído pelas enzimas de restrição presente nelas.

Assim, os pesquisadores utilizaram a forma purificada dessas enzimas para a separação de certas partes específicas do DNA. O que é altamente eficiente já que cada enzima digere somente uma determinada sequência de bases nucleotídicas no DNA e sempre gerando um corte específico.

Algumas enzimas clivam o DNA em um mesmo ponto, produzindo extremidades cegas. Outras Fazem cortes escalonados nas duas fitas, as extremidades escalonadas(extremidades coesivas) são utilizadas na engenharia genética para unir duas peças de DNA diferentes.

Selecionando vetores

O principal motivo dos vetores é funcionar como um veículo para a replicação de sequências de DNA.

Assim, diversas moléculas de DNA podem ser usadas como vetores para o processo, basta que sejam auto replicativas. Isso, pois quando estiver dentro da célula, o vetor seja capaz de se replicar-se.

Além disso, avalia-se a preservação, proteção do DNA e o tamanho, pois moléculas menores são mais fáceis de manipular em relação às grandes, que são mais frágeis.

Outro tipo de vetor são os plasmídeos, chamados de vetores biofuncionais. Sua principal vantagem é que eles podem mover sequências de DNA clonadas de um organismo para outro d iferente, como de uma bactéria para um fungo. Assim, ele é muito útil para o processo de modificação genética de organismos multicelulares.

Também podemos utilizar o DNA viral como vetor. Diferente dos plasmídeos, ele consegue aceitar fragmentos de DNA exógenos de tamanhos muito maiores. O DNA colocado no vírus pode ser clonado nas células que são suas hospedeiras naturais. Retrovírus, adenovírus e herpesvírus são usados para inserir genes corretivos em células humanas que contenham genes defeituosos.

Inserção de DNA exógeno nas células

Para a produção do rDNA as moléculas de DNA devem ser manipuladas fora da célula e depois introduzidas em células vivas. O método para inserir o rDNA depende do vetor e da célula hospedeira.

Um plasmídeo, por exemplo, para ser inserido em uma célula utiliza um processo chamado de transformação. Nele, as células captam o DNA do ambiente circundante. As células que realizam a transformação naturalmente são chamadas de competentes, já as que não a realizam naturalmente são incubadas em uma solução de CaCl (Cloreto de Cálcio) e depois misturadas com o DNA clonado e submetidas a um choque térmico moderado, para que possam realizar a transformação.

Outro processo é a eletroporação, em que as células são submetidas a uma corrente elétrica abrindo microporos na parede celular, onde o DNA atravessa para dentro da célula.

Também há o processo de fusão. Nele adiciona-se polietilenoglicol em protoplastos que estão em solução, o que aumenta sua taxa de fusão. A nova célula híbrida tem o DNA derivado das duas células “parentais” e pode sofrer uma recombinação natural.

Em células vegetais, o DNA é disparado por meio das paredes de celulose usando uma pistola de genes. A pistola está carregada com partículas microscópicas de tungstênio ou ouro cobertas com DNA e são lançadas por uma explosão de hélio.

Em células animais o DNA é inserido por microinjeção, com o uso de uma micropipeta de vidro com o diâmetro menor que o da célula. Ela perfura a membrana plasmática e o DNA é inserido por meio dela.

Obtenção do DNA

Há dois meios de recuperar o DNA clonado:

1. Biblioteca de genes

Essas bibliotecas são formadas por um conjunto de clones com diferentes fragmentos de DNA. Cada “livro” é uma linhagem bacteriana ou fago que contém 1 fragmento. Elas são fundamentais para a manutenção e recuperação de clones.

Os fragmentos de cada clone foram adquiridos pelo genoma completo da célula modificada que sofreu uma lise e que seu DNA precipitado foi separado por enzimas de restrição. Assim, os fragmentos de cada clone formam o genoma completo de uma célula modificada.

2. DNA sintético:

Em certas circunstâncias, os genes podem ser produzidos in vitro, com o uso de máquinas de síntese de DNA.

Nessas máquinas é usado um teclado para entrar a sequência de nucleotídeos desejados. Então um microprocessador controla a síntese do DNA a partir do suprimento de nucleotídeos armazenados e dos demais reagentes necessários. Porém, apenas cadeias de 120 nucleotídeos podem ser sintetizados por este método. Deste modo para criar cadeias maiores, devem ser sintetizados fragmentos e depois uni-los para formar a cadeia completa.

A maior dificuldade para essa abordagem é que deve ser conhecida a cadeia do gene para que possa ser sintetizada.

Aplicações da engenharia genética

1. Aplicações terapêuticas

Uma aplicação é a produção de insulina. Ela é uma proteína produzida pelo pâncreas que regula a absorção de glicose do sangue.

Pessoas com diabetes utilizam injeções de insulina obtida do pâncreas de animais abatidos, o que era bem caro e ineficiente. Assim, devido ao alto valor da insulina humana e a sua pequena quantidade de nucleotídeos, a indústria farmacêutica buscou a produção sintética desse hormônio.

Foram construídos os genes sintéticos, que foram inseridos em um vetor plasmidial e ligado à extremidade de um gene codificando a enzima ß-galactosidase. Assim, foram usadas duas culturas bacterianas de E. Coli, cada uma produzindo uma das cadeias polipeptídicas da insulina. Por fim, as cadeias produzidas eram recuperadas da bactérias, separados da ß-galactosidase e unidos para produzir a insulina humana.

2. Aplicações na Agricultura

Os seres humanos sempre fizeram uma seleção genética de plantas que fossem mais desejáveis para eles, mas esse processo sempre demandou muito tempo e trabalho.

Atualmente, o cruzamento e a produção de plantas foi extremamente modificado pelo uso de células vegetais multiplicadas em cultura. Clones de células vegetais podem ser multiplicados em grande número e depois induzidas a regenerarem plantas completas, que irão gerar sementes.

Para isso, o DNA recombinante é introduzido nas células vegetais por meio do plasmídeo TI presente na bactérias Agrobacterium tumefaciens. Quando essa bactéria infecta as plantas, uma parte do plasmídeo TI, o T-DNA, estimula a multiplicação celular no local, formando um tipo de tumor.

Assim, os cientistas usam o plasmídeo TI como um meio de transportar o DNA geneticamente modificado para a planta. Eles inserem os genes exógenos no T-DNA e re-introduzem o plasmídeo na bactéria e usam-na para inserir o plasmídeo TI recombinante em uma célula vegetal. Ela por sua vez, pode ser utilizada para gerar uma nova planta que expresse o gene exógeno.

3. Aplicações científicas

A biotecnologia está bem próxima da nanotecnologia, que se baseia na criação de circuitos eletrônicos ao nível molecular da matéria. Nela há computadores e robôs do tamanho de moléculas que podem ser usados na detecção de contaminação alimentar, doenças em plantas, como armas biológicas e muitas outras funcionalidades.

Com o avanço cada vez maior da nanotecnologia, cada vez ela necessita de peças cada vez mais pequenas. Algo que algumas bactérias podem fornecer. Pesquisadores da Associação Norte Americana de Investigações Geológicas têm cultivado bactérias anaeróbicas capazes de reduzir o selênio tóxico (Se⁴⁺) em selênio elementar (Se⁰) não tóxico estruturados em nanoesferas, que pode ser utilizado para criação e desenvolvimento de equipamentos na nanotecnologia.

Recomendações de vídeos

Nós recomendamos 2 vídeos do canal Kurzgesagt – In a Nutshell. O primeiro fala sobre o uso da engenharia genética em alimentos; O segundo fala sobre o uso do DNA recombinante para retardar o envelhecimento humano:

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